Métodos para cuantificar la absorción de glucosa en cultivos celulares

 

La glucosa es la principal fuente de energía para muchos organismos, y su absorción es un proceso crítico en biología. Esta hexosa es transportada a través de la membrana celular y es retenida en la célula mediante fosforilación. En mamíferos, este proceso es llevado a cabo por una familia de transportadores de glucosa (GLUT) y por algunas hexoquinasas intracelulares.

Es importante tener en cuenta que medir la absorción de glucosa no es lo mismo que medir el consumo de glucosa. La absorción ocurre de manera rápida, en una escala de tiempo de 10 minutos o menos, y está directamente relacionada con la actividad de los transportadores, mientras que los cambios en el consumo de glucosa implican múltiples vías y típicamente requieren varias horas.


¿Por qué medir la absorción de glucosa?

 

La absorción de glucosa es indicador de diferentes procesos. Por un lado, los cambios en la absorción de glucosa pueden reflejar cambios generales en el metabolismo, pero por otro lado también se puede relacionar estos cambios con procesos más específicos. Por ejemplo, en células tumorales, la medida de absorción de glucosa sirve para monitorizar la sobreexpresión de transportadores de glucosa o identificar inhibidores del transporte de glucosa. En células de músculo o de tejido graso, puede servir para monitorizar cambios en la translocación de GLUT4 tras la estimulación con insulina. En células inmunitarias, la medida de la absorción de glucosa se puede usar para monitorizar la transformación de ciertos tipos celulares de un estado a otro.

 


Métodos tradicionales de medición

 

Los ensayos disponibles para evaluar la absorción de glucosa se diferencian en el sustrato que utilizan para el transporte a través de los transportadores de glucosa. Puesto que la glucosa se dirige a distintas rutas una vez  entra en interior de la célula, es necesario utilizar análogos de la glucosa no metabolizables. Uno de ellos es el sustrato fluorescente 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose), que se acumula en las células y funciona adecuadamente en experimentos de imagen. el inconveniente de este sustrato es que, al ser de mayor tamaño que la glucosa, no está claro si su transporte es equivalente al de la glucosa y por tanto puede ser un indicador de la actividad transportadora de glucosa poco preciso .

Otro análogo de la glucosa en 2DG (2-deoxyglucose). Esta molécula se transporta y fosforila como la glucosa, pero al no ser modificada después por otras enzimas se acumula en las células como 2DG6P (2-deoxyglucose-6-phosphate).

Durante mucho tiempo, el principal método para medir la absorción de glucosa se ha basado en la utilización de un análogo radiactivo (3H-2DG), y en la medida del 3H-2DG6P (1) acumulado. Aunque el método es sensible y funciona bien, requiere múltiples pasos de lavado e implica el uso de material radiactivo.

 

 

Existen otros métodos no radiactivos, que utilizan 2DG y miden la acumulación de 2DG6P mediante la acción de la G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) (2) . Esta enzima oxida la 2DG6P y produce NADPH, que puede usarse para generar sondas en ensayos de absorbancia o fluorescencia. Estos ensayos son aptos para trabajar en formato de placa multipocillo, pero requieren múltiples pasos de pre-procesamiento. Debido a la reacción de detección, el ensayo colorimétrico es más sensible que el fluorescente en este caso, y puede detectar cantidades muy pequeñas de 2DG6P. Pero aún así, ambos ensayos tienen una ventana de señal muy pequeña pequeña (esto es, la señal por encima del background sin 2DG6P ), que limita su uso.

 

Figura 1. Comparativa de los ensayos de detección enzimáticos.

 

Se realizó una titulación de 2DG6P utilizando los métodos luminescente, fluorescente y colorimétrico. Los resultados se muestran como la señal dividida entre el control sin 2DG6P.

 

Figura 2. Comparativa de los ensayos radiactivo y luminiscente.

 

Se analizó la absorción de glucosa en pocillos con 20,000 ó 50,000 células HCT116, iniciada con el tratamiento con 2DG 1mM durante 10 minutos, mediante el método luminiscente (Panel A) y radiactivo (Panel B). Se añadió Cytochalasin B (50µM) para determinar el background de los ensayos.


Glucose Uptake-Glo™ Assay

 

Recientemente, Promega ha desarrollado un ensayo luminiscente para cuantificar la absorbancia de glucosa basado en el mismo principio que los ensayos mencionados previamente: la acumulación de 2DG6P y su detección mediante la actividad enzimática de la G6PDH (3) . Este ensayo luminiscente tiene varias ventajas:

Gran sensibilidad, similar a la del ensayo radiactivo, pero sin pasos de lavado ni uso de radiactividad.

Ventana de señal más amplia que los ensayos fluorescentes o colorimétricos, haciendo más fácil la detección de pequeños cambios y necesitando menos optimización.

 

Se puede utilizar en ensayos de high-throughput screening debido al bajo número de falsos positivos y a la estabilidad de la señal (tipo Glo).

Este ensayo luminiscente puede detector la absorción de glucosa en una población de tan solo 5.000 células, con un ratio signal-to-background mayor de 3, y con una señal lineal hasta 50,000 células por pocillo.

El Glucose Uptake-Glo(TM) Assay es, por tanto,  un método no radiactivo apto para trabajar en placas multi-pocillo, que combina simplicidad y alta sensibilidad.

 

 

Figura 3. Comparativa con método radiactivo. Protocolo sencillo en formato mix -mesure

 


Referencias

  1. Yamamoto, N. et al. (2015) Measurement of glucose uptake in cultured cells. Curr. Protoc. Pharmacol. 71, 12.14.1–26.
  2. Saito, K. et al. (2011) An enzymatic photometric assay for 2-deoxyglucose uptake in insulin-responsive tissues and 3T3-L1 adipocytes. Anal. Biochem. 412, 9–17.
  3. Valley, M.P. et al. (2016) A bioluminescent assay for measuring glucose uptake. Anal. Biochem. 505, 43–50.

Ensayos metabólicos

Metabolite Detection Assays

 

Otto Warburg, premio Nobel en 1931 por la obra “El metabolismo de los tumores”, demostró que las células tumorales presentan un metabolismo basado en la glucólisis -fermentación anaeróbica- , originándose una cascada de sucesos mitocondriales  que concluyen en la inmortalidad celular y el proceso neoplásico.

Es obvio que el consumo de nutrientes, el metabolismo y la producción de energía están fuertemente conectados y regulados entre sí.

Promega ha desarrollado nuevos ensayos de detección en placa basados en tecnología bioluminiscente para medir los metabolitos centrales de la glucólisis y la glutaminolisis y estudiar las diferencias metabólicas en estas condiciones.

Los ensayos tienen capacidad multiplex y emplean bajos volúmenes permitiendo su uso en plataformas robóticas tipo high-throughput. 

• Sensibilidad: Se necesita un bajo número de células por pocillo (1000 cells/pocillo)
• Linearidad: De 2 a 3 logaritmos, permitiendo ensayar distintas concentraciones de metabolitos
• Amplituds: S/Bmax > 100 que permite discriminar pequeños cambios


Descarga de posters

Document IconBioluminescent Metabolite Detection Assays for Investigating Metabolic Pathways

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Document IconBioluminescent Metabolite Assays Enable Easy Measurement of Changes in Tumor Biology

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Polimerasas Hot Start con/sin glicerol y fabricadas bajo condiciones cGMP

 

GoTaq® MDx Hot Start Polymerase

 

La polimerasa GoTaq® MDx se comercializa unida a un anticuerpo patentado que bloquea la actividad enzimática hasta que se produce el paso de desnaturalización inicial de 94-95 ° C .

La preparación de las reacciones se puede realizar, por tanto, a temperatura ambiente sin miedo a que se produzcan dímeros o amplificaciones secundarias.

Características:

  • Fabricado bajo cGMP
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Protocolos

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